金瑞鴻捷(廈門)生物科技有限公司

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• POCKIT的检测原理为何？
  POCKIT的检测原理为聚合酶连锁反应(polymerase chain reaction, PCR)，利用具有专一性的引子(primer)针对特定的核酸序列进行扩增反应。目前PCR技术已经广泛的运用在人类疾病的检测、亲子鉴定、法医鉴定、遗传学研究等各种需要核酸侦测的领域。同时此一发明也获颁1993年诺贝尔化学奖，大幅的增加疾病检测的灵敏度，为近代分子生物学领域的最重大成就之一。
• 为何POCKIT的设备操作可以比较传统的PCR简单？反应时间可以比较短？
  一般而言PCR在反应过程需要三种不同的温度，分别是利用高温解离DNA双股结构(92 – 95℃, denaturing)，利用降低温度使专一性引子黏合于特定序列(37 – 65℃, annealing)，以及再升温至最适于热稳定性DNA聚合酶活性的温度(72℃)进行延长反应(extension)。因此相关的操作设备必须能够快速的升温与降温，同时具备有高阶的温控系统。这使得设备变得相当复杂，重复的升降温也造成设备容易损坏，和反应时间的增加。
  
  POCKIT则是利用热对流的原理，此一物理现象即是描述当针对装有液体的容器底部加热时，由于上方表面较冷的液体比重较高，因此会因为重力向下移动；下方受热的液体则因为比重较低，因此会被挤到向上移动，因此会自然形成液体的循环。当较热的液体流动至表面时，又会因为环境的散热而变冷，较冷的液体流动至底部时又会因为受热而变热，所以此一循环可以一直持续下去，进而形成稳定的温度梯度。此时如果藉由容器的设计，利用最适的管径与高度，巧妙的控制对流的时间与散热的速率，就可以形成适合PCR的反应环境。当我们在特殊设计的容器中放入PCR反应的试剂，并且控制底部的加热温度在92 -95℃之间，当试剂流至底部时，就可以进行解离DNA双股结构的反应(denaturing)，当液体循环至容器顶端并且降温时，就可以进行引子黏合(annealing)，之后再循环至较热区域进行延长反应(extension)。换言之，当热对流不间断的过程之中，PCR的反应也随之完成。
  
  因此，POCKIT的优势就变的显而易见。首先，因为只需单纯的底部单一温度控制，因此不需复杂的控温系统与降温系统，可以大幅的轻量化，并且更加耐用。第二，自然的温度梯度取代机械式的升降温，使得反应更加稳定，避免机械故障，同时省去升降温所需的时间。POCKIT系统将热对流的速率控制在每一圈15 – 20秒左右，远比传统的PCR有效率，因此可以大幅缩减反应所需要的时间。
• POCKIT的试剂与一般的PCR试剂有何不同？
  POCKIT的试剂与传统的PCR非常相似，包含有引子、dNTP、反应缓冲液、热稳定性DNA聚合酶、与核酸模板(template)等。因为POCKIT是利用荧光信号侦测PCR反应产物，因此尚需如real-time PCR一般加入荧光探针(probe)，这也同时提高了反应的专一性。
  
  为了稳定热对流的流速，降低液体与管壁间的作用力，促进温度梯度的形成，以及提升DNA聚合酶的效率，POCKIT的反应缓冲液 – Uni-ii buffer中添加有若干的特定化学物。为了适用于更为宽广的引子条件，我们提供了高盐与低盐两种反应缓冲液，以供使用者选择。这也是POCKIT试剂与一般PCR最大的不同之处。
• POCKIT的引子在设计上与一般的PCR试剂有何不同？
  与real-time PCR类似，并应依照下列的基本规则设计：
  ● 产物大小应小于150盐基对(bps)，一般而言愈小愈好。
  ● Tm应在58 – 62℃之间
  ● 避免4个以上的连续相同盐基
  ● 3'末端的5个盐基避免含3含以上的G与C
  ● G与C的比例应该占全部的20 – 80%之间
  ● 总长度应在15 – 25个盐基之间
  
• POCKIT的荧光探针在设计上与一般的real-time PCR试剂有何不同？
  最适用于POCKIT的荧光探针为TaqMan probe，其基本的设计规则如下：
  ● 5'端荧光团应使用FAM (520 nm)或 JOE、VIC (550nm)
  ● 3'端荧光抑制染剂(quencher dye)应用black hole quencher (BHQ1)或是minor groove binder (MGB)
  ● Tm应在68 – 72℃之间 – 高于引子10℃
  ● 与引子间应至少有一个mer 的距离以避免立体干扰
  ● 避免4个以上的连续相同盐基
  
  以下为与一般real-time PCR不同之处
  ● G与C的比例应该占全部的40 – 80%之间
  ● 总长度应在15 – 30个盐基之间，短比长好
  ● 5'端与模板间的黏合强度要强(较大的负自由能，ΔG)
  ● 应避免设计在模板二级结构的稳定区域
  
• 是否一定要使用POCKIT专用的毛细管进行反应？
  是的。因为以下的原因：
  ● 光学塑料材质：荧光透光性强
  ● 医疗塑料等级：无DNase/RNase污染
  ● 专利底部金属环设计：加热均匀
  ● 完美管径与管高比例：提供热隔绝恒温PCR的最佳环境
  ● 内径平整：稳定热对流循环
  ● 紧配内盖：避免试剂挥发污染
  
• 是否有已经商品化的试剂可以直接使用，而不需自行设计？
  有的，可以运用于POCKIT系统并且已经商品化的试剂如下：
  ● IQ plus系列：为针对水产养殖市场所开发的试剂组劑組
  ● PetNAD系列：为针对宠物市场所开发的试剂组
  ● POCKIT kits for food animal系列：为针对家畜禽养殖市场所开发的试剂组
  详细的内容请参考公司网站或是各品牌的网站
• 已经商品化的POCKIT试剂是否也可以用在传统的PCR或是real-time PCR之上？
  可以，但是因为以下的原因并不建议
  ● 反应条件未于传统PCR或是real-time PCR上最优化
  ● 引子与酵素的浓度高于传统PCR或是real-time PCR所需，较易产生非专一性反应
  ● 不含被动性荧光染剂(passive dye, 如ROX)
  ● 缓冲液系统与传统PCR或是real-time PCR不同
  
• POCKIT可以侦测RNA吗？可以执行反转录反应(reverse transcription)吗？
  可以，POCKIT内建程序中最开始就是执行50℃10分钟的反转录反应。不论是DNA或是RNA的模板，系统都会一律的执行此一步骤。POCKIT系统所提供的Uni-ii缓冲液同时适用于反转录反应以及PCR反应，使用者只需确认于反应中有添加反转录酵素(MMLV or AMV reverse transcriptase)即可。添加量与传统的PCR相同。
• POCKIT在检测运用上有那些限制？
  POCKIT是针对于核酸，也就是DNA以及RNA进行检测，因此对于感染性疾病的病源，如病毒、细菌、寄生虫等的核酸，或是某些因为特定DNA变异造成的遗传性疾病，都可以有效的检测。但是对于一些代谢的指标，如肝指数、血糖等，或是不具核酸的病源如狂牛症，以及像是毒品与禁药、农业等化学物质，则无法进行检测。
• POCKIT是新的技术吗？它的质量稳定吗？
  POCKIT是全新的技术，但是基于以下的原因，它也是非常稳定的技术
  ● POCKIT的基本原理是PCR，是分子生物领域最广为应用，最稳定的技术
  ● POCKIT的加热原理与反应采用自然界的现象 - 热对流，比机械式的控制更为简单、有效
  

  ● POCKIT的研发、生产、与销售流程皆符合医疗器材质量管理系统ISO13485:2003以及体外检测(in-vitro diagnosis, IVD)

  GMP的生产规范。

  ● POCKIT的生产制造商 - 瑞基公司，是台湾分子检测市场的标竿企业。其2011年所获奖项如下：
  　♦ 小巨人奖
  　♦ 台北生技奖金牌奖
  　♦ 行政院农委会菁创奖
  　♦ 中部科学园区创新产品奖
  　♦ 亚洲科学园区协会优良生技厂商奖
  ● 运用POCKIT技术于不同领域的学术研究已经陆续发表在全球知名期刊之上，证明这是一种有效且可以广泛运用的技术。
  ● 运用POCKIT技术所开发的试剂 - IQ plus WSSV Detection System已通过
• POCKIT是可携带式的设计吗？在操作环境上有没有限制？
  POCKIT在设计之初就是锁定现场携带式的核酸检测设备，因此当有这种需求时，可以选择投资POCKIT Xpress – 行动实验室。它包含了POCKIT核酸分析仪一台，cubee小型高速离心机一台，以及高精度移液器二支，上述设备都包装于仪器专用防水硬壳行李箱之中。行李箱内还具有专门的空间可以放置塑料类的耗材，与反应所需的试剂，足以应付现场从采集样本、核酸萃取、一直到最终PCR结果分析的所有需求。
  
  POCKIT在操作环境上仍然是有基本的限制存在，包括：
  ● 必须有稳定的交流电源供应，100 – 240V，50/60Hz
  ● 摆放仪器的平面必须相对平整
  ● 环境温度的范围为15 - 35℃
  以上二、三点皆与热对流的稳定性有关。
• POCKIT可以于单一反应检测多重标的吗？
  可以，POCKIT的光学系统可以利用窄波长滤镜(band pass filter)，收取520nm及550nm两种不同的散射光源信号，因此只要将不同标的的荧光探针分别标定合适的荧光物，如FAM (520nm)以及JOE (550nm)，即可于单一反应之中同时检测两种标的。
  
  POCKIT系統的PCR反應是利用熱對流所產生的溫度梯度所驅動，與傳統的PCR不同，因此在設計雙重標的(duplex system)的實驗時，必須要特別注意引子、探針之間產生雙重子(dimer)，以及引子、探針本身產生二級結構的可能，以避免反應之間互相干擾。
  
  双重标的系统之间多少都会彼此竞争反应资源，此一部份的设计理念与传统的双重标的PCR系统相同。
  因为荧光物质的特性，520nm的散射光信号可能会影响到550nm，因此一般建议请将主要的检测标的设计于520nm，并将次要的标的如内控制组(internal control)设计于550nm。
• 使用者可以自行设定反应条件吗？
  使用者唯一可以设定的反应条件是波长的选择，分别是520nm单波长、550nm单波长、以及520 + 550nm双波长三种选择。 在反转录以及热隔绝恒温PCR部分，经过多年的研究与测试，最广泛性且优化的反应条件组合已经被找到，并且已经成功的运用在POCKIT系统之上。为了轻量化、使用接口简单化和人性化、和可移植性设计，POCKIT将所有非必要的功能都尽量舍弃，因此使用者无法自行设定相关的反应条件。然而，单一反应条件、人性化使用接口、与极简的设计理念，正是POCKIT与众不同之处。
• 使用者于反应结束后需要自行判读结果吗？
  POCKIT内建Android智能型手机芯片系统，会于反应前后搜集、运算、监控内部光学系统的运作，并于反应结束后直接将荧光信号的变化比转化为结果，并且显示于触控屏幕上。因此使用者无需自行判读结果，所有的工作POCKIT都会代为执行。同时反应前后光学系统的定位照片、荧光原始读值、荧光比、与判读结果，都会存档于SD卡中以开机时间为目录名的目录之下，可供用户随时做为查询、记录、确认之使用。
• POCKIT是定量的系统吗？可以像real-time PCR一样定量吗？
  POCKIT的光学系统设计与试剂设计原理都与real-time PCR非常相似，有潜力可以发展成定量的系统，但是为了考虑具有定量需求的现场检测项目有限，同时为了贯彻轻量化、使用接口简单化和人性化、和可移植性设计，POCKIT舍弃了定量功能，而只具备了判读正负的定性能力。 当科技持续进步，使得芯片运算与控制能力进一步提升时，下一代的POCKIT将会很有机会可以像real-time PCR一样，具有核酸定量能力，同时保有可携式的特性。
• 请问要如何优化自行设计的POCKIT引子对？判定的标准为何？
  PCR反应的成败有相当程度的依赖引子的质量，其可能的影响因子如下：
  ● 引子的设计：Tm、二级结构、双重子(dimer)的形成可能等
  ● 引子的合成质量：供货商的经验、合成原物料的质量、纯化的方法等
  ● 引子的浓度
  
  使用者基本上可以依照Q4所述的原则进行设计，并建议如下：
  

  ● 左右两端的引子除了原本的设计之外，都可以试着以多一两个盐基或是少一两个盐基的方式多合成几条，并藉由不同的

  排列组合中，找到最佳的引子对

  ● 合成时要求引子必须以PAGE纯化
  ● 合成时要求引子必须以PAGE纯化
  ● 测试不同的引子对比例，以及浓度，以及使用的酵素浓度，找寻最佳条件。
  ● 在灵敏度上，可藉由阳性样品的序列稀释，测试不同条件的稀释终点，以最灵敏的条件为最佳
  ● 在灵敏度上，可藉由阳性样品的序列稀释，测试不同条件的稀释终点，以最灵敏的条件为最佳
  ● 一般而言，POCKIT系统的灵敏度至少可达100 copies/反应
• 我没有接触过荧光探针，请问我可以从哪里获得设计荧光探针的知识？
  可以上网找寻有关TaqMan probe的相关信息，或是与瑞基公司的技术团队联络。其基本的设计原理已于Q5的回答中详述。
• 瑞基公司有提供荧光探针的合成与测试服务吗？
  并没有，但是我们提供POCKIT系统荧光探针的设计咨询服务，以及改善方向的建议。
• 请问市售的PCR缓冲液与酵素可以直接用在POCKIT这套系统上吗？
  可以，但是并不建议。如Q3的回答中所描述，为了稳定热对流的流速，降低液体与管壁间的作用力，促进温度梯度的形成，以及提升DNA聚合酶的效率，POCKIT的反应缓冲液 – Uni-ii buffer中添加有若干的特定化学物，而这些物质是市售PCR缓冲液中所没有的。因此，仍然建议使用POCKIT的专属缓冲液。POCKIT专用的Uni-ii buffer中已含有最佳浓度的dNTP，因此使用者不需另行添加。
  
  至于酵素部份，因为市售的品牌与种类繁多，使用者必须自行测试与比较，如果不想浪费时间在测试酵素上，也可以直接选购POCKIT专用的酵素。酵素的使用量会依不同的反应系统而不同，于条件优化之前，可先依传统PCR及RT-PCR的建议使用量添加，之后再依优化的结果酌予增减。

Q&A问题

• POCKIT
• TACO